技術(shù)交流

佐劑(Adjuvant)，或者叫免疫佐劑（immunologicadjuvant)，是指與抗原同時或預(yù)先使用，能增強(qiáng)機(jī)體針對抗原的免疫應(yīng)答能力或改變免疫反應(yīng)類型的一類物質(zhì)。一般來說，佐劑是非特異性免疫增強(qiáng)劑。獸用疫苗佐劑可以看作是疫苗的一種添加劑，目前最常用的佐劑為鋁佐劑、油乳佐劑和蜂膠佐劑，多用于滅活疫苗、亞單位疫苗和重組蛋白疫苗等。

獸用疫苗中藥佐劑是以中藥或其提取組份、成分制成的與抗原一起使用或配合獸用疫苗使用，輔助發(fā)揮免疫效用的物質(zhì)。具有免疫增強(qiáng)功能的獸用中藥成方制劑往往也作為疫苗佐劑使用。

中藥佐劑主要來源于天然植物中提取的某些具有免疫活性的成分，這些成分具有毒性低、易于代謝的特點(diǎn)，既可以降低抗原需要量，提升獸用疫苗免疫效果，又可以通過替代其他佐劑，減少毒副反應(yīng)，為解決佐劑的安全性和局部反應(yīng)問題提供新的方案。

我國常用的獸用疫苗中藥佐劑主要包括蜂膠佐劑、多糖與糖苷佐劑、殼聚糖佐劑、皂苷佐劑等；近年來批準(zhǔn)的配合疫苗使用的中藥制劑，也可以看作是一種獸用疫苗佐劑新形態(tài)。

2.1 蜂膠佐劑

蜂膠是由從植物中提取的樹脂和蜜蜂分泌物經(jīng)特定工序加工而成的膠狀物質(zhì)。以蜂膠作為佐劑研制的禽類和豬用疫苗，如禽霍亂蜂膠疫苗、新城疫－減蛋綜合征蜂膠二聯(lián)滅活疫苗等都能引起較早、較持久和強(qiáng)的免疫保護(hù)；用于豬圓環(huán)病毒疫苗，能顯著增強(qiáng)豬群的特異性免疫和非特異性免疫，且具有良好的安全性。蜂膠佐劑毒性低，接種后不良反應(yīng)小。近年來，蜂膠佐劑的應(yīng)用已經(jīng)十分廣泛，禽大腸桿菌類滅活苗、禽多殺性巴氏桿菌類滅活苗、豬鏈球菌類滅活苗等蜂膠苗得到了市場認(rèn)可，在特定種類疫苗中，蜂膠佐劑疫苗的生產(chǎn)數(shù)量已經(jīng)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過傳統(tǒng)佐劑疫苗。蜂膠混合油乳劑、鋁膠作為獸用疫苗佐劑在畜禽臨床生產(chǎn)中的應(yīng)用也取得比較理想的效果。

2.2 多糖與糖苷佐劑

多糖是由至少10個單糖分子脫水聚合而成的高分子碳水化合物，可形成直鏈或分支長鏈，結(jié)構(gòu)復(fù)雜且龐大。多糖在自然界分布廣泛，從天然產(chǎn)物中分離出的多糖化合物多達(dá)數(shù)千種。具有佐劑活性的多糖有黃芪多糖、人參多糖、黨參多糖、枸杞多糖、淫羊藿多糖、當(dāng)歸多糖、靈芝多糖、香菇多糖、牛膝多糖等。多糖作為疫苗佐劑，生物相容性良好、毒性低、安全性高；作為抗原易被多種免疫細(xì)胞識別，免疫反應(yīng)迅速。具有補(bǔ)益功能的中藥所含多糖在臨床應(yīng)用中的表現(xiàn)效果更加明顯。黃芪多糖和蒲公英多糖能夠提升水產(chǎn)疫苗哈維氏弧菌滅活疫苗對牙鲆的保護(hù)效果。獸醫(yī)領(lǐng)域已將黃芪多糖和香菇多糖開發(fā)成產(chǎn)品在生產(chǎn)實(shí)踐中廣泛推廣應(yīng)用。

2.3 殼聚糖佐劑

殼聚糖(β－(1－4)－2－氨基葡聚糖)是存在于昆蟲甲殼中的堿性多糖，由甲殼素經(jīng)濃堿處理脫乙?；笾苽涠伞ぞ厶遣蝗苡谒?，可溶于部分無機(jī)酸中，性質(zhì)穩(wěn)定。殼聚糖佐劑生產(chǎn)成本相對較低，而且具有良好的生物相容性，安全性較高；殼聚糖在黏膜中可以產(chǎn)生分泌型IgA抗體，具有黏膜吸附性優(yōu)勢，可以用于黏膜免疫。殼聚糖能在較溫和條件下進(jìn)行一系列化學(xué)修飾，形成具有不同生物特性的衍生物。殼聚糖－三磷酸鹽是近年來研發(fā)出的多聚糖衍生物，克服了殼聚糖在生理pH下溶解度低的缺點(diǎn)，延長抗原釋放時間并降低降解率，從而提高疫苗的有效性。

2.4 皂苷佐劑

皂苷(Saponins)是螺旋甾烷類化合物或三萜的天然糖苷。目前皂苷類佐劑研究中以三萜皂苷類為主[6]。其中，以皂苷QuilA、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1應(yīng)用最廣。

皂甙QuilA是從薔薇科南美奎拉雅屬皂樹(QuillajaSaponariaMolina)的皮中提取而來，目前已成為亞單位疫苗及癌癥疫苗的理想佐劑。豬O型口蹄疫(FMD)疫苗中添加佐劑QuilA，能顯著提高FMD疫苗免疫后豬VP1結(jié)構(gòu)蛋白抗體以及血清中細(xì)胞因子的水平，顯著提高T淋巴細(xì)胞增殖率；將皂苷QuilA應(yīng)用于豬繁殖和呼吸綜合征病毒(PRRSV－1)改性活病毒(MLV)疫苗，可以上調(diào)I型IFN調(diào)節(jié)基因，I型和II型IFN以及炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)水平，還可以增強(qiáng)細(xì)胞對PRRSV的免疫防御。

人參皂苷Rb1對禽流感油乳劑滅活苗有較強(qiáng)的免疫增強(qiáng)作用；人參皂苷Rb1與奶牛乳房炎金黃色葡萄球菌疫苗或豬細(xì)小病毒(PPV)滅活苗混合免疫豚鼠，能明顯提高豚鼠血清抗體水平。

2.5 成方制劑類中藥佐劑

獸醫(yī)領(lǐng)域深入挖掘獸用中藥的主要和輔助免疫作用，通過嚴(yán)格的臨床試驗(yàn)，研發(fā)了幾十種用于提高動物疫苗免疫效果或免疫應(yīng)答的新獸用中藥制劑，如2011－2021年，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)了一批用于雞新城疫、法氏囊病、禽流感、口蹄疫、豬瘟、藍(lán)耳病等動物病毒性傳染病的疫苗免疫增強(qiáng)劑。

農(nóng)業(yè)農(nóng)村部批準(zhǔn)用于提高動物疫苗免疫效果或免疫應(yīng)答的新獸用中藥制劑見表1。

其中，有12種獸用中藥制劑用于“配合疫苗使用、提高免疫效果”，17種獸用中藥制劑用于“提高疫苗免疫應(yīng)答”。此類“免疫增強(qiáng)劑”通過合理應(yīng)用，可以發(fā)揮佐劑作用。

3.1 中獸醫(yī)理論免疫機(jī)制研究

早在一千多年前，我國古代的醫(yī)藥學(xué)家們就已經(jīng)開始了對免疫學(xué)的探索?！懊庖摺币辉~，最早見于中國明代醫(yī)書《免疫類方》，指的是“免除疫癘”，也就是防治傳染病。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，正氣是決定因素，正氣具有祛除邪氣、調(diào)節(jié)整體的陰陽平衡以保護(hù)機(jī)體的作用。這一認(rèn)識與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中免疫的概念基本相同，即識別異己，排斥異己，保存自己。病毒性疫病是動物感受外邪導(dǎo)致的，病毒一般屬于“熱毒”，感受熱毒的主要癥狀為發(fā)熱，并且熱度較高，而且具有發(fā)病急、發(fā)展快等特點(diǎn)，中醫(yī)把這類熱病統(tǒng)稱為溫病。病毒引起的雞法氏囊炎、禽流感、豬瘟、豬藍(lán)耳病等疫病屬于瘟疫范疇，具體辨治時以衛(wèi)氣營血辨證為主，輔以六經(jīng)辨證；以熱邪為主要病因，冬春多以風(fēng)熱、夏季多以濕熱、秋季多以燥熱為主；以邪熱熾盛為主要病機(jī)；治療原則始終圍繞邪熱，透邪出表，清泄內(nèi)熱，應(yīng)用具有“祛邪”作用的中藥將侵入體內(nèi)的“熱毒”驅(qū)除出去。

隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)的發(fā)展，運(yùn)用現(xiàn)代免疫學(xué)的理論和技術(shù)，研究中藥增強(qiáng)畜禽等動物機(jī)體的免疫功能已取得了很大成就，這對于闡明有關(guān)中獸醫(yī)理論的物質(zhì)基礎(chǔ)具有十分重要的意義。

3.2 現(xiàn)代醫(yī)學(xué)免疫機(jī)制研究

佐劑主要包括免疫調(diào)節(jié)、細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞誘導(dǎo)、抗原遞呈、抗原靶向和儲存等幾種作用方式。佐劑增強(qiáng)免疫應(yīng)答的機(jī)制是通過改變抗原的物理形狀，增強(qiáng)抗原表面面積，延長抗原在機(jī)體內(nèi)保留時間；刺激單核吞噬細(xì)胞對抗原的遞呈能力；刺激淋巴細(xì)胞分化，增加擴(kuò)大免疫應(yīng)答能力。

有理論認(rèn)為鋁佐劑使可溶性抗原微粒化，激發(fā)樹突狀細(xì)胞的吞噬作用，也有人認(rèn)為佐劑將抗原鎖定在呈遞細(xì)胞上，加強(qiáng)抗原呈遞……

總之，佐劑可能通過不同途徑增強(qiáng)機(jī)體的免疫反應(yīng)。

3.2.1 多糖免疫作用機(jī)制

多糖可促進(jìn)免疫調(diào)節(jié)，具有多靶點(diǎn)、多功能和多因子效應(yīng)，因此可廣泛用作獸用疫苗免疫佐劑。多糖作為疫苗佐劑可提高免疫動物脾臟、胸腺和法氏囊等免疫器官指數(shù)，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活性及抗原遞呈能力，增強(qiáng)NK細(xì)胞殺傷能力，促進(jìn)樹突細(xì)胞的成熟和分化，增強(qiáng)機(jī)體對抗原的攝取能力，影響T細(xì)胞亞群的種類和數(shù)量，改變Th1、Th2型免疫應(yīng)答反應(yīng)的類型，促進(jìn)B淋巴細(xì)胞增殖，刺激細(xì)胞因子及抗體的產(chǎn)生等。而多糖作為配體通過與Toll樣受體(Toll－likereceptor，TLR)、甘露糖受體(mannosereceptor，MR)、C型凝集素受體(C－typelectinsreceptor，CLR)、清道夫受體(scavengerreceptor，SR)等受體分子結(jié)合，激活下游信號通路，進(jìn)而發(fā)揮上述免疫活性。

黃芪多糖、當(dāng)歸多糖、淫羊藿多糖等均能不同程度地促進(jìn)細(xì)胞增殖和抵抗病毒感染。黃芪多糖較氫氧化鋁和白油吐溫能夠激發(fā)較多的白細(xì)胞和淋巴細(xì)胞數(shù)，進(jìn)而提高機(jī)體免疫力。香菇多糖具有T細(xì)胞特異免疫佐劑的特性。香菇多糖能夠增強(qiáng)胸腺細(xì)胞對細(xì)胞因子的敏感性，從而增強(qiáng)了這些細(xì)胞向殺傷性T細(xì)胞的分化。豬苓多糖單獨(dú)給藥能顯著提高小鼠腹腔巨噬細(xì)胞的吞噬率和吞噬指數(shù)，增強(qiáng)記憶性T細(xì)胞的活性，與乙肝疫苗合用可進(jìn)一步提高吞噬率；豬苓多糖可使垂直傳播鴨乙型肝炎病毒(DHBV)的麻鴨血清DHBV陰轉(zhuǎn)并改善肝臟病變。枸杞多糖可明顯增加小鼠外周T淋巴細(xì)胞百分?jǐn)?shù)，對T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有明顯的選擇促進(jìn)作用，對胸腺T淋巴細(xì)胞的增殖效應(yīng)最強(qiáng)，對脾T淋巴細(xì)胞亦有促進(jìn)作用。從浮萍(LemnaminorL．)的愈傷組織中提取的果膠多糖具有口服免疫佐劑特性，能增加遲發(fā)型過敏反應(yīng)和血清中溶菌酶抗體IgG反應(yīng)，增加小腸組織中丙二醛濃度和骨髓過氧化物酶活性。

3.2.2 皂苷免疫作用機(jī)制

皂苷作為疫苗佐劑，在進(jìn)入機(jī)體后會誘導(dǎo)各種免疫相關(guān)細(xì)胞的分化成熟，比如中性粒細(xì)胞的富集，誘導(dǎo)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，以及巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞(DC)的分化成熟。皂苷能有效增強(qiáng)疫苗的免疫原性是基于皂苷在注射部位具有“倉庫效應(yīng)”，緩慢釋放，持久起效，而且還會上調(diào)相關(guān)免疫基因mRNA的表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞因子和趨化因子的分泌。

QuilA佐劑作用機(jī)理包括：與細(xì)胞膜上的膽固醇形成復(fù)合物；誘導(dǎo)產(chǎn)生特異性MHCI抗原

制性細(xì)胞毒性T細(xì)胞；誘導(dǎo)產(chǎn)生多種細(xì)胞因子，如白細(xì)胞介素IL－10、γ干擾素；提高動物機(jī)體對抗原的特異性抗體的水平，刺激產(chǎn)生IgG1、IgG2b和IgG2a抗體亞類。

人參皂苷Rg3可誘導(dǎo)DC分化和成熟，并通過促進(jìn)DC分泌IL－12來促進(jìn)T／NK細(xì)胞的增殖和活化，從而達(dá)到增強(qiáng)機(jī)體免疫功能的作用。人參總皂苷通過提高馬立克氏病病毒(Marek＇sdiseasevirus，MDV)的L－meq基因含量抑制meq基因的相關(guān)轉(zhuǎn)錄，從而誘導(dǎo)馬立克氏病腫瘤細(xì)胞系—MSB－1細(xì)胞的凋亡。

3.2.3 其他中藥及組份與免疫機(jī)制

很多類中藥均有提高免疫功能的作用，以補(bǔ)益類中藥為主，涉及補(bǔ)氣、補(bǔ)血、補(bǔ)陰、補(bǔ)陽類藥物。黃芪可使巨噬細(xì)胞形態(tài)呈多樣性，其表面積增加，吞噬功能增強(qiáng)，還可提高巨噬細(xì)胞內(nèi)糖原和黏多糖物質(zhì)，有利于加強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬活力，加強(qiáng)對抗原處理和加強(qiáng)免疫調(diào)節(jié)作用。人參可提高巨噬細(xì)胞的吞噬活性，誘導(dǎo)干擾素生成，刺激細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞活性。有研究發(fā)現(xiàn)人參總提取物與Al(OH)3膠合用有協(xié)同作用，與滅活豬細(xì)小病毒(PPV)免疫豚鼠，抗體滴度明顯提高。

應(yīng)用蜂膠或配合抗原引入機(jī)體，既能引起特異性免疫應(yīng)答，又能啟動非特異性防御機(jī)制，能刺激免疫系統(tǒng)增加抗體產(chǎn)量，增強(qiáng)補(bǔ)體活性和吞噬細(xì)胞的能力。蜂膠可以顯著提高CD4＋T細(xì)胞、CD8＋T細(xì)胞數(shù)量和血清中IL－4含量。淫羊藿－蜂膠佐劑不僅對特異性免疫起作用，還具有增加小鼠和雛雞的NK細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活性及血漿cAMP、cGMP含量等非特異免疫功能。

殼聚糖中游離的氨基和羥基可通過氫鍵和靜電吸引作用吸附于機(jī)體黏膜上。通過作用于Toll樣受體誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞和樹突細(xì)胞的活化，提高共刺激膜蛋白CD80和CD86的表達(dá)，從而激活免疫系統(tǒng)。

黃芪多糖、淫羊藿多糖、蜂膠黃酮、人參皂苷組成復(fù)方與新城疫疫苗混合后免疫雛雞，能顯著促進(jìn)淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化，提高血清抗體效價，部分時間點(diǎn)顯著強(qiáng)于油佐劑。

中藥也可通過激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)、誘生多種細(xì)胞因子來增強(qiáng)動物免疫功能。大量的研究證實(shí)，中藥及中藥復(fù)方制劑可以通過細(xì)胞免疫、體液免疫提高機(jī)體的抗病力和抵抗力，增強(qiáng)畜禽等動物機(jī)體的免疫功能。

中藥產(chǎn)地不同，采收時間不同，藥物的特性及有效組份、有效成分存在一定的差異性和復(fù)雜性，如多糖多為粗品，無法確定活性多糖結(jié)構(gòu)，生產(chǎn)工藝研究需要解決的問題較多。

我國獸醫(yī)領(lǐng)域已成功將蜂膠佐劑、多糖與糖苷佐劑、殼聚糖佐劑、皂苷佐劑應(yīng)用于各類動物疫苗，也有將殼聚糖微球與白油佐劑混合作為禽流感疫苗佐劑的成功嘗試。開展了中藥佐劑生產(chǎn)工藝、獨(dú)立包裝配合疫苗使用等研究和探索。與疫苗一體化生產(chǎn)、用于注射給藥的中藥佐劑，有效解決了殼聚糖不易溶于水、大部分多糖溶解性低的問題。同時，某些成分如皂苷類還存在一定的溶血性、細(xì)胞毒性和神經(jīng)毒性，需要提升減毒增效工藝生產(chǎn)水平，針對溶血問題，采用脂質(zhì)體包被等技術(shù)，如將巴西藜蘆皂苷(QB－80)包裹在脂質(zhì)中制成納米佐劑(IMXQB－80)，消除溶血作用并保留佐劑效果。針對殼聚糖黏膜免疫在機(jī)體中存在各種阻礙，如口服易在胃中被消化，滴鼻在鼻腔內(nèi)作用時間短等問題，可以將殼聚糖等制成小于1μm的納米顆粒(NPs)，發(fā)揮NPs抗原高效遞呈作用。如將新城疫病毒F基因DNA疫苗封裝到殼聚糖納米粒中，促進(jìn)黏膜免疫傳遞系統(tǒng)的持續(xù)釋放，提高免疫效率。各類中藥佐劑生產(chǎn)工藝比較見表2。

基金項(xiàng)目：”十四五”國家重點(diǎn)研發(fā)計劃項(xiàng)目（2020YFD1801105）

作者簡介：顧進(jìn)華，研究員，從事獸藥質(zhì)量管理與研究。

通訊作者：張存帥，E-mail:zcs738@sohu.com

作者單位：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部中獸醫(yī)生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室