技術(shù)交流

1.1 制定背景

1992年，F(xiàn)AO組織領(lǐng)導(dǎo)的“全球根除牛瘟計劃開始實施，在各國政府、WOAH、國際原子能機(jī)構(gòu)(IAEA)等國際、區(qū)域組織的密切協(xié)作下，于2011年宣布全球消滅牛瘟。2011年5月，WOAH通過決議，明確以下幾點：銷毀依舊保藏的病毒或?qū)⑵浒踩２卦谧畹蛿?shù)量的、經(jīng)過認(rèn)可的高等級生物安全實驗室內(nèi)；保持對牛瘟潛在復(fù)發(fā)的警惕；停止所有未經(jīng)批準(zhǔn)的研究活動。然而，實驗室內(nèi)牛瘟病毒材料的泄漏風(fēng)險、獸醫(yī)和養(yǎng)殖業(yè)者等一線人員對牛瘟專業(yè)知識的匱乏、新一代診斷技術(shù)和不含牛瘟活病毒的疫苗的缺乏，以及合成生物學(xué)的快速發(fā)展和生物恐怖主義都是可能造成牛瘟再暴發(fā)不容忽視的因素。在此背景下，F(xiàn)AO和WOAH聯(lián)合制定了全球牛瘟行動計劃(GlobalRinderpestActionPlan，GRAP)，明晰了所有利益相關(guān)方在應(yīng)急管理各個階段的角色和職責(zé)。2017年，該計劃草案在尼泊爾加德滿都召開的第3屆維持全球無牛瘟國際會議公布。這既是全球?qū)用婢S持無牛瘟的框架綱領(lǐng)性文件，也是對各國家、區(qū)域牛瘟計劃的補(bǔ)充性文件。

1.2 主要內(nèi)容

《全球牛瘟行動計劃》以牛瘟再暴發(fā)的應(yīng)急管理為主要內(nèi)容，提出了五個階段，并為各階段所需的各項關(guān)鍵活動提供指導(dǎo)，見表1。

1.3 重要機(jī)構(gòu)

FAO－WOAH牛瘟聯(lián)合秘書處于2012年3月獲準(zhǔn)成立，聯(lián)合咨詢委員會(JointAdvisoryCommittee，JAC)于2012年4月完成委員遴選，二者是GRAP的具體牽頭機(jī)構(gòu)，也是FAO和WOAH間的協(xié)調(diào)機(jī)構(gòu)。秘書處主要協(xié)調(diào)和實施與根除后時代相關(guān)的所有活動，包括且不限于：牛瘟病毒封存與批準(zhǔn)的授權(quán)；牛瘟病毒保存設(shè)施評價；維護(hù)診斷能力；疫苗開發(fā)、生產(chǎn)和儲存政策；批準(zhǔn)研究請求；應(yīng)急管理規(guī)劃。委員會主要就牛瘟病毒的處理、儲存和運輸?shù)仁乱?，以及收到的研究提案組織研討，并向FAO和WOAH提供咨詢意見。自2012年起，JAC已發(fā)布17份牛瘟報告，持續(xù)推動維持全球牛瘟無疫狀態(tài)相關(guān)工作。此外，F(xiàn)AO和WOAH還分別指定牛瘟參考中心和參考實驗室，在后牛瘟?xí)r代開展牛瘟診斷以排除或確診牛瘟病例，同時設(shè)立牛瘟病毒保藏機(jī)構(gòu)，對牛瘟病毒進(jìn)行封存。

2.1 含牛瘟病毒的材料

為了將牛瘟病毒泄漏的風(fēng)險降至最低，F(xiàn)AO和WOAH分別通過決議，要求各成員銷毀含牛瘟病毒的材料，或?qū)⑵滢D(zhuǎn)移至被批準(zhǔn)的牛瘟病毒保藏機(jī)構(gòu)。含牛瘟病毒的材料(RinderpestVirusContainingMaterial，RVCM)包括牛瘟病毒的野生和實驗室毒株、牛瘟病毒疫苗株(包括效期內(nèi)和過期疫苗)、被感染或懷疑被感染動物的組織、血清和其他臨床材料、含有或編碼活病毒的診斷材料、含有牛瘟病毒獨特核酸或氨基酸序列的重組麻疹病毒屬病毒(分段或非分段)以及全長基因組材料(包括病毒RNA和病毒RNA的互補(bǔ)DNA副本)，但RVCM不包括不能并入復(fù)制性麻疹病毒屬病毒或類似病毒的麻疹病毒屬病毒核酸亞基因組片段。

針對RVCM，F(xiàn)AO和WOAH的策略是：推動非指定保藏機(jī)構(gòu)銷毀RVCM或?qū)⑵銻VCM轉(zhuǎn)移至指定保藏機(jī)構(gòu)，呼吁指定保藏機(jī)構(gòu)降低RVCM保藏數(shù)量。據(jù)2011年進(jìn)行的一項調(diào)查顯示，全球150個國家和地區(qū)中，有35個國家和地區(qū)的44個機(jī)構(gòu)報告保存有含牛瘟病毒的材料。2013年起，WOAH開始每年進(jìn)行此類調(diào)查，同年調(diào)查結(jié)果顯示，23個國家和地區(qū)保存有含牛瘟病毒的材料，其中13個保存有強(qiáng)毒株，19個保存有致弱疫苗株，9個兩者同時保存。得益于FAO、WOAH的積極推動和各國的積極響應(yīng)，截至2021年，全球共有12個國家的14個機(jī)構(gòu)保存有含牛瘟病毒的材料，見圖1。2022年6月，越南銷毀了其保藏的RVCM。

2.2 牛瘟病毒保藏機(jī)構(gòu)

FAO－WOAH認(rèn)可的牛瘟病毒保藏機(jī)構(gòu)分為A類和B類(表2)。A類為儲存包含牛瘟病毒材料的牛瘟病毒保存設(shè)施，不包括疫苗儲備及疫苗毒種；B類為僅儲存制成疫苗、疫苗儲備以及僅用于疫苗生產(chǎn)材料的牛瘟病毒保存設(shè)施。2015年，農(nóng)業(yè)部指定中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所(國家動物病原微生物菌毒種保藏中心)(以下簡稱“中監(jiān)所”)為我國牛瘟病毒唯一指定保藏機(jī)構(gòu)。自2016年起，中監(jiān)所開始申報FAO－WOAH牛瘟病毒保藏機(jī)構(gòu)(A類和B類)。2019年WOAH第87屆全體大會通過決議，認(rèn)可中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所為牛瘟病毒保藏機(jī)構(gòu)(A類和B類)，成為全球第五家FAO－WOAH認(rèn)可的牛瘟病毒保藏機(jī)構(gòu)，加入保藏機(jī)構(gòu)國際網(wǎng)絡(luò)建設(shè)體系。目前，南非、印度、土耳其、伊朗和俄羅斯的相關(guān)機(jī)構(gòu)仍保存有RVCM，這些機(jī)構(gòu)尚未獲得FAO和WOAH的認(rèn)可。

2.3 牛瘟疫苗儲備

目前，全球牛瘟疫苗儲備主要有兩種，分別是LA－AKO株和RBOK株疫苗。歷史上，LA－AKO株主要用于東亞高度易感牛群，如日本黑牛和韓國黃牛的免疫；RBOK株則在印度次大陸、中東、近東和非洲的牛瘟控制中發(fā)揮了重要作用。截至2020年，NIAH儲存有50萬劑量的LA－AKO株疫苗，以及相當(dāng)于70萬疫苗劑量的抗原，AU－PANVAC儲存有250萬劑量的RBOK株疫苗。CIRAD儲備的RBOK株疫苗種子庫可制備約80萬劑量疫苗。此外，意大利IstitutoZooprofilatticoSperimentaledelLazioedellaToscana(IZSLT)計劃申請成為B類保藏機(jī)構(gòu)，進(jìn)而將儲存5百萬劑量RBOK株疫苗。在我國牛瘟根除過程中，主要使用了牛瘟兔化毒株、牛瘟綿羊化兔化毒株和牛瘟山羊化兔化毒株等疫苗。這些疫苗與LA－AKO株疫苗一樣，最初都來源于日本中村Ⅲ系兔化毒株。

3.1 小反芻獸疫疫苗

用于牛瘟免疫項目牛瘟病毒與小反芻獸疫病毒同屬麻疹病毒屬，二者病原學(xué)特性極為相似。為明確小反芻獸疫疫苗是否可用于牛瘟免疫，進(jìn)而減少牛瘟疫苗保藏數(shù)量，降低牛瘟再暴發(fā)風(fēng)險，F(xiàn)AO和WOAH在全球根除牛瘟后首次批準(zhǔn)了牛瘟活病毒的實驗活動。相關(guān)研究結(jié)果表明，牛瘟疫苗可保護(hù)綿羊和山羊的小反芻獸疫，但小反芻獸疫疫苗Nigeria／75／1株和Sungri／96株均不能有效預(yù)防牛瘟。

3.2 “測序和銷毀”項目

2011年全球根除牛瘟后，仍有多個機(jī)構(gòu)保存有含牛瘟病毒的材料。風(fēng)險評估表明，在全球根除牛瘟的背景下，牛瘟仍然是最危險的農(nóng)業(yè)生物恐怖主義威脅源之一，實驗室?guī)齑娌《镜囊馔馐褂檬桥Ｎ猎俦┌l(fā)的最高風(fēng)險路徑。降低病毒庫存數(shù)量、限制病毒使用以及提升實驗室生物安全水平將有效降低此類風(fēng)險。盡管病毒材料銷毀或轉(zhuǎn)移至高等級生物安全實驗室封存工作取得了一些進(jìn)展，但總體進(jìn)度依然緩慢。為進(jìn)一步推動銷毀工作，F(xiàn)AO和WOAH于2015年啟動了“測序和銷毀”項目，旨在對保藏的牛瘟病毒進(jìn)行全基因組測序后進(jìn)行銷毀，以便將來牛瘟再暴發(fā)時可追溯來源，甚至根據(jù)全基因組序列重建牛瘟病毒。該項目也是FAO和WOAH批準(zhǔn)的另一個牛瘟研究項目。項目啟動以來，英國Pirbright研究所首先響應(yīng)，當(dāng)年6月即銷毀了3500瓶左右的病毒材料(約50株病毒)。2019年6月，Pirbright研究所銷毀了其保存的最后的病毒材料。法國和日本已對少量病毒進(jìn)行了測序，美國已向FAO和WOAH提交了實驗申請，并就病毒材料滅活方法進(jìn)行了評價。

3.3 其他實驗活動

目前，F(xiàn)AO和WOAH僅批準(zhǔn)了上述兩項涉及含牛瘟病毒材料的實驗項目。為確保已公開發(fā)表的研究中沒有未經(jīng)FAO和WOAH批準(zhǔn)的實驗活動，Budke等對2011－2021年發(fā)表的來自21個數(shù)據(jù)庫的623篇文獻(xiàn)進(jìn)行了分析，除新聞、綜述等文章外，有17篇涉及實驗室研究，其中也包括上述兩個項目。除上述項目外，相關(guān)研究主要涉及疫苗和免疫學(xué)、診斷方法、酶活性以及基因組測序等內(nèi)容。這些實驗活動多在全球宣布消滅牛瘟之前開展，或未使用活病毒，并未發(fā)現(xiàn)未經(jīng)批準(zhǔn)的實驗活動。

3.3.1 疫苗和免疫學(xué)

針對牛瘟病毒H蛋白，以單克隆抗體C1株為基礎(chǔ)，建立的C－ELSIA方法是WOAH指定的血清學(xué)檢測方法，在根除牛瘟過程中發(fā)揮了重要作用。Li等解析了牛MHCⅠ型復(fù)合物N?01801的晶體結(jié)構(gòu)，該復(fù)合物可識別牛瘟病毒H蛋白表位肽IPA(IPAYGVLTI)。Buczkowski等利用噬菌體展示和反向遺傳學(xué)技術(shù)，對C1結(jié)合表位進(jìn)行突變，構(gòu)建了牛瘟病毒標(biāo)記毒株，有望用于區(qū)分感染／免疫，并進(jìn)一步探討了該技術(shù)應(yīng)用于小反芻獸疫疫苗的前景。

3.3.2 診斷方法

為建立更安全、準(zhǔn)確、便捷的牛瘟實驗室診斷方法，各國學(xué)者做了有益嘗試?；陔p啟動寡核苷酸引物技術(shù)，Yeh等建立了一步法多重RT－PCR方法，可同時鑒別裂谷熱病毒、藍(lán)舌病病毒、牛瘟病毒和小反芻獸疫病毒。Lung等利用多重RT－PCR和自動微陣列技術(shù)，可同時檢測水泡性口炎病毒、牛病毒性腹瀉病毒1型和2型、牛皰疹病毒1型、藍(lán)舌病病毒、惡性卡他熱病毒、牛瘟病毒和副痘病毒等牛的8種重要病毒，牛瘟病毒檢測下限可達(dá)1TCID50／mL。vanRijn等構(gòu)建了包含牛瘟病毒片段的重組新城疫病毒，為已廣泛應(yīng)用的牛瘟PCR診斷方法提供了更加安全的不含RVCM的陽性對照。復(fù)制缺陷型水皰性口炎病毒假病毒包裝系統(tǒng)可不使用活的感染性病毒，大大降低了病毒意外感染的風(fēng)險。Logan等利用復(fù)制缺陷型水皰性口炎病毒假病毒包裝系統(tǒng)測定病毒中和抗體，大大降低了病毒意外感染的風(fēng)險，同時也可進(jìn)一步用于血清樣品的回顧性分析。

3.3.3 主要編碼蛋白的功能

Chinnakannan等研究了牛瘟病毒、麻疹病毒、小反芻獸疫病毒和犬瘟熱病毒等4種麻疹病毒屬成員的V蛋白對干擾素信號通路的封閉作用。牛瘟病毒V蛋白N端結(jié)構(gòu)域可結(jié)合STAT1，富含半胱氨酸的C端特異性結(jié)構(gòu)域可與IFN受體相關(guān)激酶Jak1和Tyk2作用，完整的V蛋白發(fā)揮了對IFN信號通路的封閉作用。印度學(xué)者利用昆蟲細(xì)胞和大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)獲得牛瘟病毒L蛋白，并對L蛋白的活性進(jìn)行了研究。重組牛瘟病毒L蛋白的C端(1717－2183aa)可在體外對加帽mRNA甲基化修飾，催化活性位于結(jié)構(gòu)域Ⅲ(1756－2228aa)。此外，L蛋白C端(1640－1840aa)還表現(xiàn)出RTPase和NTPase活性，這種活性具有雙金屬特異性，與牛痘病毒加帽酶D1和桿狀病毒LEF4蛋白相似。

3.3.4 全基因組測序

隨著分子生物學(xué)的快速發(fā)展，各國學(xué)者對牛瘟病毒及其疫苗株進(jìn)行全基因組測序，為將來應(yīng)對牛瘟再暴發(fā)提供了最重要的基礎(chǔ)信息。牛瘟病毒Fusan株(B株)對牛致病，其兔化弱毒中村Ⅲ株(L株)對牛和水牛不致病，經(jīng)全基因組測序分析，推測牛瘟病毒堿基／氨基酸在P、C、V基因的置換是兩株毒株對牛致病性存在差異的重要因素。牛瘟病毒Fusan株經(jīng)兔、雞胚以及雞胚成纖維細(xì)胞等不同培養(yǎng)系統(tǒng)連續(xù)傳代后獲得3株弱毒疫苗株，即L72株、LA77株和LA96株，Jeoung等對這些毒株進(jìn)行全基因組測序分析，結(jié)果表明V基因差異可能是各毒株致病性不同的原因。牛瘟兔化雞胚化毒株(LA株)經(jīng)Vero細(xì)胞培養(yǎng)傳代后獲得LATC06株，Yeh等比較了LATC06株與L13株、LA株、RBT1株、Egypt84株、KabeteO株以及RBOK株的全基因組序列，發(fā)現(xiàn)LA株和LATC06株的H蛋白分別有3個預(yù)測的N－糖基化位點，LA株H蛋白上可引起體液免疫的6個表位也同樣存在于LATC06株。LA－AKO株是牛瘟疫苗的主要儲備毒株之一，Takamatsu等對其進(jìn)行了全基因組測序，發(fā)現(xiàn)在核苷酸水平上，LA－AKO株與親本NakamuraⅢ株的一致性為98％；在氨基酸序列上，LA－AKO株與NakamuraⅢ株有13個氨基酸發(fā)生替換，LA－AKO株與LA77株則僅有7個氨基酸發(fā)生替換。

1920年，在比利時進(jìn)口動物中暴發(fā)的牛瘟促使人們在動物疫病防治方面開展國際合作，這也是促使1924年成立世界動物衛(wèi)生組織的主要原因。經(jīng)過近百年的努力，人類終于成功根除牛瘟。但不可忽視的是，牛瘟再暴發(fā)的風(fēng)險依然存在，維持全球牛瘟無疫狀態(tài)任重而道遠(yuǎn)。2022年9月，F(xiàn)AO－WOAH牛瘟聯(lián)合秘書處在羅馬組織召開了第5屆“維持全球無牛瘟”外聯(lián)會議。結(jié)合相關(guān)工作經(jīng)驗，提出以下幾點防控建議：

一是總結(jié)借鑒經(jīng)驗，助力疫病防控。根除牛瘟是世界獸醫(yī)史上的偉大成就，回顧我國及全球根除牛瘟的歷程，取得的寶貴經(jīng)驗主要有三方面：一是組織方面，國家政治意愿與社會動機(jī)堅定支持，建立了國際協(xié)調(diào)機(jī)制與專業(yè)獸醫(yī)隊伍，制定了科學(xué)防控規(guī)劃，發(fā)動群眾、依靠群眾，堅持群防群治；二是技術(shù)方面，對牛瘟的流行病學(xué)有深入了解，可提供安全、有效、質(zhì)量可控和經(jīng)濟(jì)、便捷的疫苗，建立了穩(wěn)定的實驗室診斷技術(shù)及可靠的疫病監(jiān)測網(wǎng)絡(luò)體系；三是客觀因素，牛瘟病毒血清型單一，病毒宿主和傳播途徑相對單一，流行僅限于少數(shù)區(qū)域，可終生免疫。牛瘟的成功根除，讓各國學(xué)者將目光聚焦到下一個可能的目標(biāo)—小反芻獸疫。小反芻獸疫俗稱“羊瘟”，與牛瘟在病原學(xué)特性及致病機(jī)理等方面極為相似。2015年，F(xiàn)AO制定了《全球控制和根除小反芻獸疫策略》(PPRGCES)，確定了2030年根除小反芻獸疫的目標(biāo)。目前，全球根除小反芻獸疫計劃(PPRGEP)的第一個五年計劃(2017－2021)已為策略的實施奠定了基礎(chǔ)。

二是做好技術(shù)儲備，確保生物安全。目前，我國已制定《國家突發(fā)重大動物疫情應(yīng)急預(yù)案》，但尚需進(jìn)一步細(xì)化牛瘟疫情相關(guān)應(yīng)急預(yù)案。在FAO－WOAH批準(zhǔn)框架下，牛瘟病毒保藏機(jī)構(gòu)可開展實驗活動。但自全球根除牛瘟以來，我國尚未開展相關(guān)實驗活動。隨著現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，以及“測序和銷毀”項目的實施，有必要對我國保藏的牛瘟病毒基因組特性開展研究。應(yīng)不斷落實落細(xì)牛瘟風(fēng)險評估和各項操作程序，進(jìn)一步提升實驗室工作人員、獸醫(yī)從業(yè)人員和社會公眾對牛瘟的認(rèn)識。國家牛瘟參考實驗室應(yīng)積極探索非感染性診斷方法等研究，以更好的技術(shù)水平和能力應(yīng)對牛瘟再次暴發(fā)的風(fēng)險，確保我國生物安全。

三是深化國際交流，促進(jìn)機(jī)構(gòu)建設(shè)。目前，F(xiàn)AO－WOAH認(rèn)可的保藏機(jī)構(gòu)已有7家，非認(rèn)可機(jī)構(gòu)也正在積極申請認(rèn)可。但從降低風(fēng)險的長期角度來看，有可能進(jìn)一步減少牛瘟病毒保藏機(jī)構(gòu)，特別是保藏有牛瘟病毒的A類機(jī)構(gòu)。我國牛瘟病毒保藏機(jī)構(gòu)應(yīng)積極拓寬國際交流，深度參與全球牛瘟保藏機(jī)構(gòu)間網(wǎng)絡(luò)建設(shè)，充分利用各保藏機(jī)構(gòu)定期召開的情況通報研討會和FAO舉辦的“維持全球無牛瘟”國際會議等平臺，密切追蹤牛瘟最新進(jìn)展，不斷加強(qiáng)自身建設(shè)，在助力維持全球牛瘟無疫狀態(tài)的同時，確保我國牛瘟種質(zhì)資源的生物安全和國家利益。

作者簡介：杜鵬飛，博士，獸醫(yī)師，從事菌（毒）種保藏與檢測工作。

通訊作者：王靜文。E-mail：echowongbj@gmail.com

作者單位：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所