技術交流

食品動物使用獸藥后，肉蛋奶等動物性食品中獸藥殘留對消費者可能產(chǎn)生毒害作用，影響人類健康和消費安全，因此，控制動物性食品中獸藥殘留問題已成為獸藥研發(fā)和保障食品安全的重要內(nèi)容。食品動物獸藥殘留試驗資料主要包括獸藥最大殘留限量標準、獸藥殘留檢測方法標準和休藥期確定三個方面內(nèi)容。本文結合近年來食品動物獸藥殘留試驗注冊資料的評審主要內(nèi)容及常見問題進行綜述，旨在為食品動物用獸藥的研發(fā)與注冊提供參考。

獸藥最大殘留限量(maximumresiduelimit，MRL)是指食品動物用藥后，允許存在于食物表面或內(nèi)部的該獸藥殘留的最高量/濃度(以鮮重計，表示為μg/kg)。獸藥MRL是動物性食品獸藥殘留是否超標，是否滿足人類安全消費的一個重要判斷指標。

獸藥的安全性、使用范圍和分析方法是建立MRL的基礎，其中安全性是決定因素。獸藥MRL的建立步驟主要包括：確定最大無作用劑量(NOEL)、確定日允許攝入量(ADI)、確定殘留標志物和總殘留、食物消費系數(shù)和MRL計算等。需要制定MRL的動物性食品主要包括動物肌肉、肝臟、腎臟、脂肪等常見可食組織以及奶、蛋、蜂蜜等產(chǎn)品。食品動物用獸藥有的需要制定MRL，有的對動物和人類無任何毒副作用，或在動物體內(nèi)代謝迅速，不會形成有效的藥物殘留，不需要制定MRL。

1.1 已有MRL的藥物

對于仿制藥或改良型新獸藥，官方已經(jīng)發(fā)布了有效成分的MRL及相關內(nèi)容，包括ADI、殘留標志物、動物種類、可食組織及MRL值，注冊時可以直接進行引用。目前，已發(fā)布的獸藥MRL主要來自：(1)我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部與國家衛(wèi)生健康委員會、國家市場監(jiān)督管理總局聯(lián)合發(fā)布的《食品中獸藥最大殘留限量》(GB31650-2019)和《食品中41種獸藥最大殘留限量》(GB31650.1－2022)以及農(nóng)業(yè)部或農(nóng)業(yè)農(nóng)村部相關公告；(2)國際食品法典委員會(CAC)的限量標準(CX/MRL2-2018)；(3)歐盟EMA的限量標準((EU)No37/2010)；(4)美國FDA的限量標準(21CFR556PartB)；(5)日本肯定列表以及加拿大、澳大利亞等其他國家的限量標準。

1.2 需制定MRL的藥物

對于國內(nèi)外官方均未發(fā)布又需要制定MRL的藥物，注冊時就要提供MRL標準及其制定過程。我國已初步起草了獸藥MRL標準制定技術規(guī)范，目前還未正式發(fā)布。因此，MRL的制定仍然參考國際上已有方法，國際上認可的有影響力的MRL制定方法有：

(1)JECFA的方法；

(2)歐盟EMA的方法；

(3)美國FDA的方法。

國內(nèi)新制定MRL時，大都參考這三種方法進行計算，然后比較三種方法得到的MRL值，一般將數(shù)值較低者確定為最終擬定的MRL標準。

食物消費系數(shù)和計算方法的差異是導致上述三種方法計算結果差異的主要因素。WHO推薦的食物消費系數(shù)為一個60kg體重的人一天的動物性食物消費量：哺乳動物或禽肉500g(其中：肌肉300g，肝臟100g，腎臟50g，脂肪50g)；或者魚肉300g；另加蛋100g，奶1500g，蜂蜜50g。由于飲食習慣的差異，我國居民在動物性食品消費量上遠達不到WHO推薦的食物消費系數(shù)，但本著最小化食品安全風險的原則，目前我國制訂MRL時仍采用WHO推薦的食物消費系數(shù)。

1.3 獸藥MRL的外推

獸藥MRL在不同動物間的外推最早是通過魚類間外推提出的，后來延伸到反芻動物間、非反芻哺乳動物間和禽類間的外推。獸藥MRL外推既可以保證動物性食品安全，又可以降低研發(fā)成本。獸藥MRL進行外推的前提是藥物在已知動物體內(nèi)的代謝與待外推動物體內(nèi)的代謝相似，主要代謝途徑和主要代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生比例相似；已知動物的殘留標志物與待外推動物的殘留標志物一致，如果殘留標志物為原形藥物，則更適合外推。

目前，我國尚未制定獸藥MRL外推的方法，國際上已發(fā)布的獸藥MRL外推方法有：

(1)CAC的外推方法；

(2)歐盟的外推方法((EU)2017/880)。進口注冊產(chǎn)品滿足已發(fā)布外推方法的前提條件，通過外推得到的MRL，也是認可的。

1.4 獸藥MRL評審常見問題

獸藥MRL標準評審時常見問題主要有：

(1)不提供MRL標準，或不需要制定MRL又未提供充分的理由；

(2)提供的不是最新的ADI或MRL；

(3)新制定MRL時確定的殘留標志物不合理；

(4)新制定MRL的計算過程不詳細，或者只采用一種方法計算得出較高的MRL值；

(5)提供的MRL標準范圍不全，缺少某種可食組織的MRL又未提供充分的理由；

(6)進口注冊產(chǎn)品的MRL高于我國現(xiàn)行MRL標準，相關試驗未執(zhí)行我國的MRL標準等。

這里說的獸藥殘留檢測方法標準是指獸藥批準上市后，對市場上肉蛋奶等動物性食品進行食品安全抽檢所使用的殘留檢測方法標準，應區(qū)別于殘留消除試驗不同時間點樣品檢測所使用的方法。因此，應嚴格按照農(nóng)業(yè)部公告第2223號要求，對有效成分尚無國家獸藥殘留檢測方法標準的產(chǎn)品制定殘留檢測方法標準，在批準獸藥注冊時，和獸藥質(zhì)量標準一并發(fā)布實施。

2.1 直接引用已有殘留檢測方法標準

目前，我國已發(fā)布的動物性食品中獸藥殘留檢測方法標準有500余項，主要以GB、GB/T、農(nóng)業(yè)部或農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告、S/N等多種形式發(fā)布。官方已發(fā)布的或正在社會征求意見的殘留檢測方法標準，如果適用范圍包含了申報產(chǎn)品的靶動物可食組織，且方法靈敏度滿足當前的MRL標準，都可以直接進行引用，將標準文本附在注冊資料中即可。如果已發(fā)布了相關殘留檢測方法標準，但適用范圍缺少靶動物某種可食組織，就需要按照下面的方法補充制定缺少組織的殘留檢測方法標準。

2.2 需制定殘留檢測方法標準

對于官方?jīng)]有發(fā)布過，或者適用范圍缺少某種可食組織的藥物，需要制定相應的殘留檢測方法標準。制定時要對樣品前處理、儀器條件以及方法特異性、靈敏度、線性、回收率和精密度等技術參數(shù)進行考察。方法定量限一般應達到0．1MRL，實在達不到，至少應低于1/2MRL；測定時采用單點法，或純?nèi)軇藴嗜芤夯蚩瞻谆|(zhì)匹配標準溶液制備的標準曲線法進行定量，如LC法采用純?nèi)軇藴是€，LC-MS/MS外標法采用基質(zhì)匹配標準曲線，同位素內(nèi)標法采用純?nèi)軇藴是€等；標準曲線的線性范圍應包括定量限和2MRL(1.5MRL)所對應的濃度；回收率和精密度考察一般選擇低、中、高三個添加濃度即可，低濃度為方法定量限，中、高濃度為MRL、2MRL(1.5MRL)，也可增加1/2MRL濃度。各項技術參數(shù)原則上應滿足我國農(nóng)牧發(fā)[2003]1號文或歐盟2021/808對動物性食品獸藥殘留檢測方法的性能要求。方法靈敏度和回收率還要結合藥物MRL大小、樣品前處理過程、儀器種類和定量方法等多方面進行評價，結果穩(wěn)定可靠，基本滿足方法性能要求，也是認可的。

2.3 殘留檢測方法標準評審常見問題

獸藥殘留檢測方法標準評審時的問題相對較多，目前常見的有：

(1)缺少標準儲備液和標準工作液的保存有效期，新化合物未進行穩(wěn)定性考察；

(2)樣品稱樣量偏低，缺乏代表性，一般應2g或5g；

(3)結合態(tài)藥物缺少酶等水解步驟，或水解的溫度時間不合適；

(4)內(nèi)標法選擇的內(nèi)標物不科學，對藥物檢測造成干擾；

(5)樣品提取液體積過大或過小，所用SPE柱規(guī)格不匹配；

(6)標準曲線類型選擇錯誤，或曲線范圍窄，不能涵蓋定量限和2MRL(1.5MRL)對應的濃度；

(7)儀器條件不全，如色譜條件缺少柱溫，質(zhì)譜條件缺少電壓、溫度或氣速等關鍵參數(shù)或不同品牌儀器的參數(shù)混淆，僅監(jiān)測一對離子等；

(8)結果計算公式有誤，如樣品前處理過程中體積發(fā)生變化未在公式中體現(xiàn)；

(9)方法靈敏度與回收率試驗矛盾，如回收率試驗添加低濃度小于方法定量限，定量限濃度又未考察回收率；

(10)附錄附圖過多或過少，目前要求提供基質(zhì)相對復雜樣品(如肝臟)的一套圖譜，包括空白樣品、空白添加樣品以及相應類型的標準溶液三個圖譜；

(11)標準文本格式或兩家單位驗證報告不符合當前要求或者相互之間不一致等。

休藥期(withdrawaltime，WT)是指為符合食品安全國家標準動物性食品中獸藥最大殘留限量，使用獸藥后的動物在屠宰上市或其產(chǎn)品(蛋、奶)允許用作人的食品前停止使用獸藥的一段時間。休藥期是依據(jù)藥物在動物體內(nèi)的殘留消除規(guī)律確定的，隨動物種屬、藥物種類、制劑形式、給藥途徑及給藥劑量等不同而有差異，一般約為幾小時、幾天到幾周不等。目前，基本按照農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第326號和VICH相關指導原則開展殘留消除試驗，確定科學合理的休藥期(包括棄奶期和棄蛋期)，并在產(chǎn)品標簽說明書中明確標示出來。

3.1 殘留檢測方法學驗證

這里說的殘留檢測方法是用于靶動物殘留消除試驗不同時間點樣品檢測所用的方法，應區(qū)別于上述食品安全監(jiān)管用的殘留檢測方法標準。具體可以采用標準方法、允許偏離的標準方法以及文獻或自建的非標準方法等。為了保證分析方法準確可靠，必須對分析方法進行充分的方法學驗證。驗證時需從方法特異性、檢測限和定量限、標準曲線和定量范圍、準確度和精密度等方面進行驗證。方法定量限一般是標準曲線的最低濃度，原則上應低于1／2MRL；測定時一般采用純?nèi)軇藴嗜芤夯蚩瞻谆|(zhì)添加標準溶液制備的標準曲線法進行定量，如LC-MS／MS同位素內(nèi)標法選用純?nèi)軇藴是€，LC法或LC-MS／MS外標法采用空白基質(zhì)添加標準曲線，如選用其他類型標準曲線，應確保方法的絕對回收率；標準曲線的高低濃度范圍為定量范圍，不能用定量范圍外推的方法計算未知樣品濃度；準確度和精密度考察一般選擇低、中、高三個添加濃度進行考察，低濃度為標準曲線的最低濃度，高濃度接近標準曲線上限，中濃度選標準曲線中間一濃度，各濃度點應涵蓋實際樣品檢測濃度。各項技術參數(shù)原則上應滿足農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第326號要求。

3.2 殘留消除實驗設計

殘留消除試驗一般在實際生產(chǎn)條件下，采集動物給藥后一段時間內(nèi)不同時間點的樣品并檢測藥物在樣品中的殘留量變化，以MRL標準為依據(jù)，采用科學的統(tǒng)計方法，一般用WT1．4或WTM1．4軟件來制定休藥期或棄奶期。如果實際殘留數(shù)據(jù)無法統(tǒng)計分析，可以用定義法確定休藥期，即所有可食組織中藥物殘留量都低于MRL的時間，考慮到動物個體差異，需再估算一段安全間隔時間即可。實驗設計時，給藥方案通常選用推薦的最大給藥劑量和最長給藥療程；受試藥物、動物及飼養(yǎng)管理、采樣時間、采樣部位、樣品檢測和數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析等要滿足農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公告第326號要求。

3.2.1可食組織休藥期

一般在主要品種的健康靶動物體內(nèi)進行殘留消除試驗，獲得的試驗數(shù)據(jù)有時候可以外推到次要品種的動物：在肉牛進行的試驗結果可以應用于非泌乳奶牛，反之亦可；成年反芻動物牛、羊的數(shù)據(jù)一般情況下可以外推到犢牛和羔羊。試驗時至少選擇4個采樣點，每個采樣點豬牛羊至少4個動物，禽至少6只動物。給藥途徑和方式須按照標簽說明書規(guī)定進行，多次注射給藥的產(chǎn)品須在動物身體左右兩側(cè)的相同部位交替進行。測定的可食組織一般包括動物肌肉、肝臟、腎臟和脂肪(或皮＋脂)，肌注和皮下注射的藥物必須采集最后一次給藥注射位點的肌肉，澆潑劑等其他經(jīng)皮給藥的藥物也要采集給藥部位的肌肉、皮下脂肪等。此時，休藥期的計算應充分考慮肌注、皮下注射或澆潑給藥部位的殘留消除試驗數(shù)據(jù)，結合肌肉MRL或其他參考值，制定給藥部位的休藥期，再與肌肉等其他可食組織的休藥期進行比較，選擇最長休藥期作為藥物最終監(jiān)管用的休藥期?？傊谛菟幤跁r間點，所有可食組織中的藥物殘留量都應低于法規(guī)規(guī)定的MRL或ISSRV；如果沒有MRL或IS?SRV，可以選用其他的參考值，如ADI或暴露限量等。

3.2.2 棄奶期

棄奶期是指泌乳動物從停止給藥到所產(chǎn)奶許可上市的間隔時間。一般而言，對泌乳期動物進行治療的藥物均需確定棄奶期。奶中藥物殘留消除試驗應選擇泌乳期的動物進行，一般高產(chǎn)奶量動物(泌乳早期)和低產(chǎn)奶量動物(泌乳晚期)每組至少各10頭。乳房灌注制劑給藥時必須同時給予4個乳區(qū)藥物。關于奶樣采集，我國目前僅規(guī)定每日兩次采取4個乳區(qū)的混合奶作為檢測樣本。對于多次給藥的產(chǎn)品，應從最后一次給藥后采樣。定義為零日棄奶期的藥物，在給藥期間也要采集奶樣。對于干乳期動物至少應有20頭，給藥必須在最后一次泌乳后和下一次分娩前進行。

3.2.3 棄蛋期

棄蛋期是指蛋雞從停止給藥到所產(chǎn)的蛋許可上市的間隔時間。由于雞蛋的形成過程與可食組織不同，因此棄蛋期評價也有其自身特點。雞蛋黃的形成時間約12日，且不同時期的蛋黃形成是套疊過程，因此棄蛋期不為零日的藥物無法合理執(zhí)行棄蛋，這使得只有零日棄蛋期的藥物才能批準用于產(chǎn)蛋雞。雞蛋中藥物的殘留標志物可能與可食組織不同，因此，雞蛋的殘留消除試驗要單獨進行。蛋的采樣要在停藥至蛋黃形成時間(12日)保證至少4個時間點，每個時間點采樣不少于10枚蛋；多次給藥的產(chǎn)品，在給藥期間也要采集蛋樣。檢測時蛋白和蛋黃混在一起檢測。

3.2.4 水產(chǎn)動物休藥期

水產(chǎn)動物休藥期是指水產(chǎn)動物停止給藥到許可起捕上市的間隔時間。藥物在水產(chǎn)動物體內(nèi)休藥期的評價過程與一般評價規(guī)則相似，但也有其自身特點，水產(chǎn)動物屬于變溫動物，休藥期與水溫密切相關。因此，水產(chǎn)藥物的休藥期一般用度日表示，如500度日是指水溫20℃時休藥期為25天，25℃時休藥期為20天。水產(chǎn)動物殘留消除試驗設計時，要保證試驗水環(huán)境相對穩(wěn)定，不受外界環(huán)境突然變化或污染影響。目前，我國批準用于水產(chǎn)動物的藥物大多以粉劑、預混劑或溶液劑為主。在給藥過程中，藥物如何被水產(chǎn)動物快速攝入體內(nèi)是需要考慮的因素，應在適應期進行測試，確定群體攝食率和體重，以確定合理給藥劑量。

3．3殘留消除試驗與休藥期確定評審常見問題

殘留消除試驗與休藥期確定評審時常見問題主要有：

(1)方法學驗證時未考察定量限的回收率和精密度；

(2)選用的標準曲線類型錯誤，或曲線范圍不合適；

(3)缺少樣品中藥物或樣品處理后藥物穩(wěn)定性考察，或考察時間偏短；

(4)未按照推薦的最大給藥劑量和最長給藥療程給藥；

(5)采樣時間點不合理，未在停藥當天采樣，或最后一個采樣點藥物濃度仍高于MRL；

(6)可食組織采樣不規(guī)范，如豬禽脂肪應是帶皮的脂肪，牛羊脂肪應是腎周圍脂肪；

(7)樣品檢測對象不是殘留標志物，未進行平行雙樣測定或質(zhì)控樣品結果不符合要求；

(8)軟件計算休藥期時未采用認可的最新的MRL標準；

(9)肌內(nèi)、皮下注射或澆潑給藥未對給藥部位采樣檢測，或休藥期計算時未執(zhí)行肌肉MRL或其他參考值；

(10)生物等效的仿制藥計算得出的休藥期較原研產(chǎn)品休藥期短，未執(zhí)行原研產(chǎn)品較長的休藥期；

(11)未明確不得用于奶牛泌乳期的牛用藥或不得用于蛋雞產(chǎn)蛋期的雞用藥，未制定棄奶期或棄蛋期等。

綜上所述，為保證動物性食品安全，制定科學合理的獸藥最大殘留限量標準、獸藥殘留檢測方法標準和休藥期，已成為食品動物用獸藥相對于寵物用獸藥在產(chǎn)品研發(fā)時必須要解決的問題。本文就目前國內(nèi)食品動物獸藥殘留試驗注冊資料的評審主要內(nèi)容及常見問題進行了綜述，希望能為我國食品動物用獸藥的研發(fā)和注冊提供參考。喚醒夏日多巴胺

作者簡介: 孫雷,研究員,主要從事獸藥殘留與食品安全、獸藥安全評價等方面工作。E-mail:57469032@qq.com

作者單位：中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所