科研動(dòng)態(tài)

摘要：為了解四川省兔出血癥病毒2型（rabbit hemorrhagic disease virus type 2，RHDV2）的流行情況及分子遺傳變異特征，采集全省范圍內(nèi)的7 525份樣品，其中發(fā)病兔場(chǎng)肝臟組織樣品117份、環(huán)境拭子樣品243份，受監(jiān)測(cè)兔場(chǎng)血液樣品3 340份、環(huán)境拭子樣品3 825份，采用商品化熒光RT-PCR試劑盒，對(duì)以上樣品進(jìn)行RHDV2檢測(cè)；對(duì)篩選出的12份肝組織陽(yáng)性樣品進(jìn)行RHDV2 VP60基因RT-PCR擴(kuò)增、測(cè)序和遺傳進(jìn)化分析。結(jié)果顯示：RHDV2流行無(wú)明顯季節(jié)性，各養(yǎng)殖品系家兔均有RHDV2感染，哺乳仔兔、幼兔、懷孕哺乳母兔死亡率分別為25%~60%、18%~45%、9%~30%。發(fā)病兔場(chǎng)肝臟樣品RHDV2陽(yáng)性檢出率為88.89%（104/117），環(huán)境樣品為46.09%（112/243）；受監(jiān)測(cè)兔場(chǎng)全血樣品RHDV2陽(yáng)性檢出率為25.99%（868/3340），環(huán)境樣品為16.29%（623/3825）。12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60基因序列長(zhǎng)度均為1 740 bp，核苷酸序列同源性為98.4%~100%，在系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹上獨(dú)成一簇；與國(guó)內(nèi)外參照毒株的VP60基因序列核苷酸同源性為93.7%~100%，編碼的氨基酸序列同源性為95.7%~99.8%。結(jié)果表明：RHDV2已開始在四川省流行，需要加強(qiáng)檢疫，重視飼養(yǎng)管理工作；其VP60基因序列出現(xiàn)了一定程度的變異，但遺傳演化相對(duì)穩(wěn)定。本研究補(bǔ)充了國(guó)內(nèi)RHDV2的分子流行病學(xué)信息，也為該病的相關(guān)防控研究和控制對(duì)策制定提供了參考。

兔病毒性出血癥（rabbit hemorrhagic disease，RHD）俗稱兔瘟，是兔的一種急性、高度致死性傳染病。RHD因潛伏期短、發(fā)病急、病程短、傳播快、死亡率高（可達(dá)100%），被我國(guó)列為二類動(dòng)物疫病。該病典型病變特征是呼吸系統(tǒng)出血，實(shí)質(zhì)器官淤血、腫大、出血，肝臟壞死，由嵌杯病毒科（Caliciviridae）兔病毒屬（Lagovirus）兔出血癥病毒（rabbit hemorrhagic disease virus，RHDV）感染引起。根據(jù)感染的RHDV基因型不同（RHDV GI.1~4），RHD可分為RHD1型（經(jīng)典型）和RHD2型兩種。其中，RHD1型曾在世界很多國(guó)家發(fā)生和流行，但隨著免疫接種等防控措施的實(shí)施，RHD1的流行得到基本控制。RHD2型由RHDV GI.2基因型毒株（以下稱RHDV2）感染引起，2010年由法國(guó)首次報(bào)道。2020年以前，RHD2主要在歐洲一些國(guó)家發(fā)生，之后出現(xiàn)在非洲國(guó)家以及美洲的美國(guó)和墨西哥，呈現(xiàn)蔓延趨勢(shì)。2020年4月我國(guó)四川省金堂縣首次發(fā)生RHD2疫情，平均死亡率為42.85%，共撲殺銷毀家兔3 500余只，給養(yǎng)殖戶帶來(lái)較大經(jīng)濟(jì)損失。國(guó)內(nèi)目前沒有預(yù)防RHD2的疫苗，也無(wú)有效的治療藥物可用，因而該病嚴(yán)重威脅著養(yǎng)兔業(yè)健康發(fā)展。

為了解四川省RHDV2的流行情況、分子流行病學(xué)特征和遺傳變異規(guī)律，本研究于2020—2021年對(duì)四川省兔場(chǎng)進(jìn)行了流行病學(xué)調(diào)查，采用熒光RT-PCR方法，對(duì)發(fā)病兔場(chǎng)的360份樣品（117份病死兔肝臟組織樣品、243份兔場(chǎng)環(huán)境拭子樣品）和705個(gè)受監(jiān)測(cè)兔場(chǎng)的7 165份樣品（3 340份全血樣品及3 825份環(huán)境拭子樣品）進(jìn)行了RHDV2核酸檢測(cè)，篩選出12份來(lái)自不同地區(qū)發(fā)病兔場(chǎng)的病原核酸陽(yáng)性樣品；設(shè)計(jì)合成2對(duì)RHDV2 VP60基因特異性引物，通過常規(guī)分子生物學(xué)技術(shù)，對(duì)12份RHDV2核酸陽(yáng)性樣品進(jìn)行了VP60基因擴(kuò)增測(cè)序和遺傳變異分析，以期為有效控制RHD2型疫情在四川省的蔓延及其控制對(duì)策制定提供參考。

毒株、菌種及試劑

2×Taq PCR Master mix、瓊脂粉和TIANgel Midi Purification Kit（DP209）等，購(gòu)自成都安雅生物試劑有限公司；DL 2 000 DNA Marker，購(gòu)自成都大連寶生物科技有限公司；病毒DNA/RNA提取試劑盒（4.0），購(gòu)自西安天隆科技有限公司；RHD2型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒，購(gòu)自四川博策檢測(cè)技術(shù)有限公司；EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液試劑盒，購(gòu)自湖南艾科瑞生物工程有限公司。

樣品來(lái)源

受檢樣品共計(jì)7 525份。其中：360份來(lái)自發(fā)病兔場(chǎng)，包括117份病死兔肝臟組織樣品和243份發(fā)病兔場(chǎng)環(huán)境拭子樣品，采自12個(gè)地市18個(gè)縣區(qū)25個(gè)發(fā)病兔場(chǎng)（表1）；7 165份血液及環(huán)境拭子樣品，采自受監(jiān)測(cè)的705個(gè)規(guī)模兔場(chǎng)，包括2020年在全省所有地市432個(gè)集中監(jiān)測(cè)規(guī)模兔場(chǎng)采集的全血樣品2 080份、兔場(chǎng)環(huán)境樣品2 345份，2021年在全省12個(gè)地市273個(gè)集中監(jiān)測(cè)規(guī)模兔場(chǎng)采集的全血樣品1 260份、兔場(chǎng)環(huán)境樣品1 480份。

樣品采集

肝臟組織樣品：對(duì)病死兔解剖，無(wú)菌采集肝臟組織，-20 ℃凍存?zhèn)溆?；環(huán)境棉拭子：采集兔養(yǎng)殖場(chǎng)地面、圈舍、食槽、排泄物等環(huán)境樣品，置于PBS緩沖液中，-20 ℃凍存?zhèn)溆?。受監(jiān)測(cè)兔場(chǎng)采樣原則：存欄500只及以上的規(guī)模兔場(chǎng)，每個(gè)兔場(chǎng)至少采集10份全血樣品和10份環(huán)境樣品；500只以下的兔場(chǎng)，采集5份全血樣品和5份環(huán)境樣品。以上樣品均由四川省動(dòng)物疫病預(yù)防控制中心收集保存。 

發(fā)病兔場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查

統(tǒng)計(jì)發(fā)病兔場(chǎng)發(fā)病時(shí)間、地點(diǎn)、家兔品系、存欄量、死亡率等基本信息，分析RHD2的發(fā)生與季節(jié)、品系等的相關(guān)性，統(tǒng)計(jì)不同生長(zhǎng)階段兔只的死亡率。

熒光RT-PCR檢測(cè)

將肝臟組織樣品研磨勻漿，離心取上清，將環(huán)境拭子樣品離心取上清，將全血樣品直接取樣，按常規(guī)方法進(jìn)行總RNA提取，使用RHD2型熒光RT-PCR檢測(cè)試劑盒進(jìn)行檢測(cè)。

VP60基因擴(kuò)增及測(cè)序

根據(jù)GenBank（http://www.ncbi.nlm.nih.gov）中的RHDV2基因組序列，通過DNAstar和Premier 5.0軟件分析后，針對(duì)VP60基因片段設(shè)計(jì)2對(duì)特異性引物（表1）。引物由成都擎科生物有限公司合成，按照合成說明書將其稀釋至10 μmol/L，-20 ℃凍存?zhèn)溆谩?/span>

將經(jīng)熒光RT-PCR檢測(cè)篩選出的12份來(lái)自不同地區(qū)發(fā)病兔場(chǎng)的RHDV2核酸陽(yáng)性肝組織樣品，提取總RNA，根據(jù)EVO M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作，以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）為模板，分別以P1/P2、P3/P4為引物，進(jìn)行RHDV2 VP60兩段基因的PCR擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后取5 μL產(chǎn)物進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析。純化回收PCR產(chǎn)物，由成都擎科生物有限公司進(jìn)行序列測(cè)定，用DNAstar軟件拼接后進(jìn)行測(cè)序結(jié)果的Blast分析。

VP60基因序列分析

使用DNAstar等軟件分析擴(kuò)增測(cè)序的RHDV2 VP60基因序列的結(jié)構(gòu)組成特征，收集GenBank中的國(guó)內(nèi)外14條不同基因型的RHDV VP60基因序列和10條RHDV2 VP60序列進(jìn)行RHDV2 VP60基因的核苷酸及其編碼氨基酸的同源性分析，同時(shí)繪制VP60基因序列系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行遺傳變異分析。

發(fā)病兔場(chǎng)流行病學(xué)調(diào)查

經(jīng)過對(duì)發(fā)病兔場(chǎng)的流行病學(xué)調(diào)查可知：RHD2流行無(wú)明顯季節(jié)性；伊拉配套系、新西蘭兔、伊普呂配套系、伊高樂配套系等多個(gè)品系家兔均有發(fā)??；哺乳仔兔死亡率為25%~60%，部分呈現(xiàn)整窩死亡，幼兔死亡率為18%~45%，懷孕哺乳母兔死亡率為9%~30%。具體情況見表2。

熒光PCR檢測(cè)

發(fā)病兔場(chǎng)　2020—2021年，累計(jì)檢測(cè)發(fā)病兔場(chǎng)117份肝臟組織樣品及243份環(huán)境樣品，檢出肝臟組織陽(yáng)性樣品104份，陽(yáng)性檢出率為88.89%，檢出兔場(chǎng)環(huán)境陽(yáng)性樣品112份，陽(yáng)性檢出率為46.09%。部分RHDV2熒光RT-PCR檢測(cè)結(jié)果見圖1。

受監(jiān)測(cè)兔場(chǎng)　2020年共檢測(cè)全血樣品2 080份，陽(yáng)性檢出率為14.18%，檢測(cè)環(huán)境樣品2 345份，陽(yáng)性檢出率為10.28%；涉及規(guī)模場(chǎng)432個(gè)，場(chǎng)點(diǎn)陽(yáng)性檢出率為8.56%，2021年共檢測(cè)全血樣品1 260份，陽(yáng)性檢出率為45.48%，檢測(cè)環(huán)境樣品1 480份，陽(yáng)性檢出率25.81%；涉及規(guī)模場(chǎng)273個(gè)，場(chǎng)點(diǎn)陽(yáng)性檢出率為39.93%。全血樣品總體陽(yáng)性檢出率為25.99%（868/3 340），環(huán)境樣品總陽(yáng)性檢出率為16.29%（623/3 825）。具體統(tǒng)計(jì)結(jié)果見表3。

VP60基因RT-PCR檢測(cè)

分別以P1/P2、P3/P4為引物，對(duì)抽提的12份RHDV2陽(yáng)性病料中的VP60基因不同片段進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，結(jié)果如圖2-A和圖2-B所示。每份RHDV2都擴(kuò)增出約1 095 bp和1 117 bp預(yù)期大小的兩條特異性DNA條帶（即VP60a和VP60b片段），陰性對(duì)照樣品無(wú)擴(kuò)增。

VP60基因測(cè)序鑒定

分別對(duì)12份RHDV2陽(yáng)性樣品的VP60基因不同片段進(jìn)行純化回收及序列測(cè)定，將測(cè)序結(jié)果拼接后進(jìn)行Blast分析。結(jié)果顯示，12條擴(kuò)增序列與GenBank中RHDV2毒株的同源性均在97%以上，表明成功擴(kuò)增出了12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60基因序列。通過DNAstar軟件進(jìn)行VP60編碼框（ORF）序列整理，分別編號(hào)為SCh202001—SCh202012。 

VP60基因序列特征

采用DNAstar生物學(xué)信息軟件MegAlign程序進(jìn)行12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60基因序列特征分析，結(jié)果受檢的12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60基因序列長(zhǎng)均為1 740 bp，編碼579個(gè)氨基酸。12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60基因序列在第18、24、99、105、114、132、213、252、321、330、363、378、399、568、612、705、723、741、765、804、828、882、885、930、1 026、1 056、1 089、1 095、1 155、1 156、1 165、1 227、1 231、1 242、1 284、1 317、1 551、1 576、1 608、1 618和1 622 bp共41處核苷酸存在突變，核苷酸序列同源性為98.4%~100%，其中114、1 156、1 165、1 231、1 576、1 618和1 622 bp 等7處為錯(cuò)義突變，其他34處均為同義突變，且SCh202004和SCh202005、SCh202007和SCh202009同源性為100%，表明12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60基因遺傳相對(duì)穩(wěn)定。

VP60基因同源性分析

通過DNAstar軟件與GenBank中的10條RHDV2毒株VP60參考序列（表2）進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)22條VP60基因序列核苷酸同源性為93.7%~100%，其中Sch202010與2020年新加坡RHDV2分離株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）同源性最低（93.7%）；推導(dǎo)的對(duì)應(yīng)氨基酸序列同源性為95.7%~99.8%，其中SCh202002、SCh202003、SCh202004、SCh202005和SCh202006與2010年法國(guó)RHDV2分離株10-32（HE800532）同源性最低（95.7%），而Sch202010與2020年新加坡RHDV2 分離株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）推導(dǎo)氨基酸同源性最低（97.2%）。結(jié)果表明，12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60基因與國(guó)外早期和最近毒株相比出現(xiàn)了一定程度變異，但仍相對(duì)穩(wěn)定。

VP60基因遺傳演化分析

通過DNAstar軟件對(duì)12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60基因序列與國(guó)內(nèi)外14條不同基因型的RHDV VP60序列和10條RHDV2 VP60序列進(jìn)行核苷酸比較，繪制系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹（圖3）。經(jīng)典型RHD毒株（GI.1毒株）和RHDV2毒株形成兩個(gè)大分支：參考的經(jīng)典型RHD毒株又分為2個(gè)分支，國(guó)內(nèi)的經(jīng)典型RHD株分別處在不同分支；RHDV2毒株也可分為2個(gè)分支，12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60序列和我國(guó)2020年RHDV2 SC2020-04株（MT383749）單獨(dú)成簇，與Sweden 2018年分離株2381（MH341513）在一個(gè)分支，與新加坡RHDV2分離株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）處于不同分支。結(jié)果表明，RHDV2毒株VP60基因序列遺傳演化可能會(huì)呈現(xiàn)復(fù)雜化趨勢(shì)，目前仍相對(duì)穩(wěn)定。

2010年法國(guó)報(bào)道出現(xiàn)RHD2后，意大利、西班牙、德國(guó)、葡萄牙、英國(guó)、挪威等多數(shù)西歐國(guó)家和亞速爾群島，以及北非和南非一些國(guó)家陸續(xù)報(bào)道了該病的發(fā)生，2019—2020年美國(guó)、墨西哥、日本、中國(guó)和菲律賓報(bào)道發(fā)生該亞型疫情，RHD2疫情流行速度快，暴發(fā)范圍廣，呈現(xiàn)出替代經(jīng)典型RHD（RHD1）趨勢(shì)。

本研究通過流行病學(xué)調(diào)查發(fā)現(xiàn)，RHD2流行無(wú)明顯季節(jié)性，常見的品系家兔均有發(fā)病，其中伊拉配套系發(fā)病死亡率較高，乳兔和幼兔死亡率高于成兔，這與國(guó)外相關(guān)報(bào)道一致。樣品檢測(cè)結(jié)果顯示，發(fā)病兔場(chǎng)和受監(jiān)測(cè)兔場(chǎng)的環(huán)境樣品陽(yáng)性率在16.29%以上，提示RHDV2傳播潛力強(qiáng)大，加強(qiáng)飼養(yǎng)管理和做好消毒等的日常預(yù)防具有重要意義。

據(jù)相關(guān)報(bào)道，我國(guó)首次發(fā)生RHD2疫情的兩個(gè)兔場(chǎng)的RHDV2 VP60基因片段核苷酸同源性為99.1%，與RHDV2參考毒株的同源性為94.1%~98.3%，屬于同一分支上，與經(jīng)典型RHD毒株的同源性為79.0%~80.0%，親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。為進(jìn)一步了解其分子流行特點(diǎn)，本研究對(duì)12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60基因全序列進(jìn)行了克隆分析。作為RHDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，VP60蛋白的氨基酸序列可分為A（1~21）、B（22~300）、C（301~328）、D（329~343）、E（344~434）和F（435~580）6個(gè)區(qū)，通過折疊成內(nèi)殼（S-shell區(qū)）和外殼（P2區(qū)）兩個(gè)主要的緊湊區(qū)域構(gòu)成衣殼，其中N端的A和B區(qū)組成內(nèi)殼區(qū)，C端的C、D、E、F區(qū)組成外殼區(qū)，分別位于N端第3l~250位和C端第477~579位氨基酸之間的主要抗原區(qū)域。本研究表明，受試的12份RHDV2 VP60基因核苷酸序列有41處突變，含34處同義突變和7處錯(cuò)義突變，即VP60蛋白的B（22~300）1處、E（344~434）2處和F（435~580）3處錯(cuò)義突變。這一點(diǎn)與金明蘭等研究RHDVYL毒株VP60基因遺傳演變分析時(shí)得出的VP60蛋白A、B、D、F區(qū)變異相對(duì)較低、C、E區(qū)變異較高的結(jié)論存在一定差異，這需要在更多RHDV2 VP60序列的變異分析上進(jìn)一步驗(yàn)證，當(dāng)然這也可能是RHDV2毒株遺傳變異的特點(diǎn)。雖然目前12份RHDV2 VP60基因的遺傳演變相對(duì)穩(wěn)定，但仍需要警惕較大變異幅度的毒株出現(xiàn)。

通過DNAstar軟件對(duì)12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60基因序列與國(guó)內(nèi)外14條不同基因型的RHDV VP60序列和10條RHDV2 VP60序列繪制系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹，發(fā)現(xiàn)12份RHDV2 VP60序列和我國(guó)2020年RHDV2 SC2020-04株（MT383749）單獨(dú)成簇，與Sweden 2018年分離株2381（MH341513）參考序列同源性較高；RHDV2毒株VP60序列同源性分析發(fā)現(xiàn)，RHDV2 VP60基因序列核苷酸同源性為93.7%~100%，其中Sch202010與國(guó)外毒株GI.2/SG-NParks 2020/M54-9（MW194928）同源性最低（93.7%），但是12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60核苷酸序列同源性為98.4%~100%，這都表明12份陽(yáng)性樣品的RHDV2 VP60基因與國(guó)外早期和最近毒株相比出現(xiàn)了一定程度變異，但遺傳相對(duì)穩(wěn)定，同時(shí)也提示目前我國(guó)RHDV2毒株VP60基因比較保守且可能存在區(qū)域性特點(diǎn)。需要注意的是，本研究克隆分析用的RHDV2毒株均為同一時(shí)期的毒株，通過系統(tǒng)發(fā)生進(jìn)化樹發(fā)現(xiàn)，國(guó)內(nèi)RHDV毒株流行時(shí)期不同，分支也不同，提示RHDV2毒株在我國(guó)很可能隨著時(shí)間和地區(qū)的改變出現(xiàn)新的變異現(xiàn)象。

本研究對(duì)四川全省1年多時(shí)間的RHDV2流行情況進(jìn)行調(diào)查和統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)RHDV2基因序列信息進(jìn)行收集比對(duì)，對(duì)12份RHDV2 VP60基因進(jìn)行了克隆測(cè)序和遺傳變異分析，發(fā)現(xiàn)RHDV2已經(jīng)在四川省多個(gè)地市存在，其VP60基因序列出現(xiàn)了一定程度的變異，但遺傳演化相對(duì)穩(wěn)定，RHDV2毒株單獨(dú)成簇。本研究補(bǔ)充了國(guó)內(nèi)RHDV2的分子流行病學(xué)信息，也為RHD2相關(guān)防控研究和控制對(duì)策制定提供了參考。