行業(yè)焦點(diǎn)

根據(jù)《獸藥管理?xiàng)l例》，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部組織制定了雞傳染性支氣管炎活疫苗非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法等4項(xiàng)檢測(cè)方法，現(xiàn)予發(fā)布，自發(fā)布之日起執(zhí)行。

　　農(nóng)業(yè)農(nóng)村部將加強(qiáng)對(duì)雞傳染性支氣管炎活疫苗等4種獸用疫苗產(chǎn)品監(jiān)督抽檢力度，對(duì)發(fā)現(xiàn)的非法添加或改變制苗用毒種行為，按照獸藥嚴(yán)重違法行為從重處罰情形嚴(yán)厲查處。

　　

附件：

　　1.雞傳染性支氣管炎活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法

　　2.雞傳染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法

　　3.雞新城疫活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法

　　4.禽用滅活疫苗中非法添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原檢測(cè)方法
 

　　農(nóng)業(yè)農(nóng)村部

　　2023年10月23日

　　附件1：雞傳染性支氣管炎活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法

　　1.適用范圍

　　1.1本方法適用于雞傳染性支氣管炎活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種的檢測(cè)。

　　1.2非法添加/改變制苗用毒種的檢測(cè)范圍為GI-1譜系(Mass-like)、GI-13譜系(4/91-like)、GI-19譜系(QX-like)和GI-

　　22譜系(LDT3-A-like)的雞傳染性支氣管炎病毒核酸。

　　2.試驗(yàn)材料

　　2.1引物

　　針對(duì)雞傳染性支氣管炎病毒(Infectious Bronchitis Virus,IBV)不同毒株基因序列差異區(qū),分別設(shè)計(jì)針對(duì)IBV的一對(duì)通用型引物和檢測(cè)GI-1譜系(Mass-like)、GI-13譜系(4/91-like)、GI-19譜系(QX-like)和GI-22譜系(LDT3A-like)的4對(duì)特異性引物，詳見(jiàn)表1。

　　表1檢測(cè)IBV的通用型引物和不同譜系毒株的特異性引物

　

　2.2陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照

　　陽(yáng)性對(duì)照:

　　GI-1譜系(Mass-like)代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(H120株),毒種編號(hào)為CVCC AV1514;

　　GI-13譜系(4/91-like)代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/49101株),毒種編號(hào)為CVCC AV1567;

　　GI-19譜系(QX-like)代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/QX01株),毒種編號(hào)為CVCC AV1568;

　　GI-22譜系(LDT3A-like)代表毒株為雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/ldt3a01株),毒種編號(hào)為CVCC AV1569。

　　以上代表毒株均來(lái)源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心。

　　陰性對(duì)照:生理鹽水或無(wú)菌水。

　　2.3試劑

　　RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑、瓊脂糖、50xTAE、DNA marker、無(wú)核酸酶水、生理鹽水。

　　3.檢測(cè)方法

　　3.1樣品稀釋

　　取疫苗按瓶簽標(biāo)示，用生理鹽水稀釋至每毫升至少含250羽份；陽(yáng)性對(duì)照按瓶簽標(biāo)示原倍或10倍稀釋后使用。

　　3.2RNA提取

　　將稀釋后的疫苗和陰、陽(yáng)性對(duì)照按商品化核酸提取試劑盒進(jìn)行RNA核酸提取。

　　3.3RT-PCR反應(yīng)

　　將3.2步驟提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作,按商品化的一步法RT-PCR試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行RT-PCR反應(yīng)。RT-PCR反應(yīng)程序如下：第一階段,反轉(zhuǎn)錄50℃30min；第二階段,預(yù)變性92℃2min;第三階段,PCR擴(kuò)增94℃30s，55℃30s,72℃1min,共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸5min。RT-PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表2:

　　3.4電泳

　　配制1%瓊脂糖凝膠,取10μL RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，120V，30min。

　　4.結(jié)果判定

　　4.1試驗(yàn)成立條件:陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)條帶,各譜系代表毒株應(yīng)擴(kuò)增出相應(yīng)大小條帶,分別為:

　　雞傳染性支氣管炎病毒通用引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為266bp的條帶;

　　GI-1譜系(Mass-like)代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(H120株)應(yīng)擴(kuò)增出大小約為360bp的條帶;

　　GI-13譜系(4/91-like)代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/49101株)應(yīng)擴(kuò)增出大小約為328bp的條帶;

　　GI-19譜系(QX-like)代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/QX01株)應(yīng)擴(kuò)增出大小約為340bp的條帶;

　　GI-22譜系(LDT3A-like)代表毒株雞傳染性支氣管炎病毒(IBV/CK/ldt3a01株)應(yīng)擴(kuò)增出大小約為787bp的條帶。

　　4.2檢測(cè)樣品如不出現(xiàn)大小約為266bp的條帶，則判定樣品中不含IBV核酸;檢測(cè)樣品如出現(xiàn)大小約為360bp的條帶，則判定樣品中檢出GI-1譜系(Mass-like)的IBV核酸;如出現(xiàn)大小約為328bp的條帶，則判定樣品中檢出GI-13譜系(4/91-like)的IBV核酸;如出現(xiàn)大小約為340bp的條帶，則判定樣品中檢出GI-19譜系(QX-like)的IBV核酸；如出現(xiàn)大小約為787bp的條帶，則判定樣品中檢出GI-22譜系(LDT3A-like)的IBV核酸。

　　附件2：雞傳染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法

　　1.適用范圍

　　1.1本方法適用于雞傳染性法氏囊病活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種的檢測(cè)。

　　1.2非法添加/改變制苗用毒種的檢測(cè)范圍為雞傳染性法氏囊病病毒超強(qiáng)毒株、中等毒力及中等偏強(qiáng)毒力毒株、弱毒力毒株、變異株的雞傳染性法氏囊病病毒核酸。

　　2.試驗(yàn)材料

　　2.1引物

　　針對(duì)雞傳染性法氏囊病病毒(Infectious Bursal Disease Virus,IBDV)不同毒力毒株基因序列差異區(qū),參考WOAH《陸生動(dòng)物診斷試驗(yàn)與疫苗手冊(cè)》第3.3.12雞傳染性法氏囊病,設(shè)計(jì)VP2高變區(qū)的一對(duì)通用引物。

　　Upper U3:5’-GCATGCGGTATGTGAGGCTTGGTGAC-3’,

　　Lower L3:5’-GAATTCGATCCTGTTGCCACTCTTTC-3’

　　2.2陽(yáng)性對(duì)照

　　雞傳染性法氏囊病病毒陽(yáng)性對(duì)照分別為：超強(qiáng)毒株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(SD1205E5株)，毒種編號(hào)為CVCC AV358，來(lái)源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心；

　　中等毒力及中等偏強(qiáng)毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(CF株),毒種編號(hào)為CVCC AV164，來(lái)源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心；

　　雞傳染性法氏囊病病毒(NF8株)，來(lái)源于乾元浩生物股份有限公司南京生物藥廠;弱毒力毒株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(B87株)，毒種編號(hào)為CVCC AV140,來(lái)源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心；

　　變異株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(LN2023株)，毒種編號(hào)為CVCC AV1570,來(lái)源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心。

　　2.3試劑

　　RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑、DNA片段回收試劑盒、限制性內(nèi)切酶EagI-HF和StuI、瓊脂糖、50xTAE、DNA marker、無(wú)核酸酶水、生理鹽水。

　　3.檢測(cè)方法

　　3.1樣品稀釋

　　取疫苗按瓶簽標(biāo)示,用生理鹽水稀釋至每毫升至少含10羽份。

　　陽(yáng)性對(duì)照病毒含量至少應(yīng)為100ELD50/0.1ml。

　　陰性對(duì)照:生理鹽水或無(wú)菌水。

　　3.2RNA提取

　　將稀釋后的疫苗和陰、陽(yáng)性對(duì)照按商品化核酸提取試劑盒進(jìn)行RNA核酸提取。

　　3.3RT-PCR反應(yīng)

　　將3.2步驟提取的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄操作。RT-PCR反應(yīng)程序如下：第一階段，反轉(zhuǎn)錄，用六聚體隨機(jī)引物作為反轉(zhuǎn)錄引物獲得cDNA，在0.2ml PCR管中加入:RNA 8μL，random hexamers(50μg/μL)1μL，10mM dNTP mix 1μL，沸水浴5min，冰浴2min；再加入10μL cDNA合成預(yù)混液，反應(yīng)體系見(jiàn)表1。

　　表1 cDNA合成預(yù)混液成分(10μL)
　　

反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:25℃10min；50℃50min；85℃5min。

　　第二階段，95℃3min；95℃40s,60℃30s，72℃40s，30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min。反應(yīng)體系見(jiàn)表2:

　　表2 PCR反應(yīng)體系(50μL)

　　3.4PCR產(chǎn)物回收、酶切利用片段回收試劑盒對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行回收,最終用32μL無(wú)核酸酶水進(jìn)行洗脫。將回收產(chǎn)物利用EagI-HF和StuI進(jìn)行酶切，酶切體系(50μL)：10x Cutsmart Buffer 5μL，DNA 30μL，EagI-HF1μL，StuI 1μL，ddH2O 13μL，混勻后37℃水浴4h。

　　3.5電泳

　　配置2%瓊脂糖凝膠,取10μl酶切產(chǎn)物進(jìn)行電泳，130V,40min。

　　4.結(jié)果判定

　　4.1試驗(yàn)成立條件,陰性對(duì)照應(yīng)無(wú)條帶,不同毒力代表毒株應(yīng)出現(xiàn)相應(yīng)大小條帶,分別為:

　　超強(qiáng)毒株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(SD1205E5株)、中等毒力及中等偏強(qiáng)毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(CF株)應(yīng)出現(xiàn)大小約為234bp、233bp和89bp條帶,實(shí)際檢測(cè)中僅可見(jiàn)234bp左右的一個(gè)條帶，原因?yàn)?33bp條帶和234bp條帶差異過(guò)小,會(huì)出現(xiàn)重疊。89bp條帶片段過(guò)小，電泳不可見(jiàn)。

　　弱毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(B87株)應(yīng)出現(xiàn)大小約為556bp條帶。

　　變異株代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(LN2023株)和中等毒力及中等偏強(qiáng)毒力代表毒株雞傳染性法氏囊病病毒(NF8株)應(yīng)出現(xiàn)大小約為322bp和234bp條帶。

　　4.2檢測(cè)樣品如出現(xiàn)大小約為556bp的條帶，則判定樣品中檢出B87株類似IBDV核酸；如出現(xiàn)大小約為234bp的條帶，則判定樣品中檢出CF株類似或者SD1205E5株類似IBDV核酸；如出現(xiàn)大小約為322bp和234bp的條帶，則判定樣品中檢出LN2023株類似株或者NF8株類似IBDV核酸。

　　4.3如需明確具體的雞傳染性法氏囊病病毒種類,可將酶切片段回收后進(jìn)行測(cè)序和blast比對(duì)。

　　附件3：雞新城疫活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種檢測(cè)方法

　　1.適用范圍

　　1.1本方法適用于雞新城疫活疫苗中非法添加/改變制苗用毒種的檢測(cè)。

　　1.2非法添加/改變制苗用毒種的檢測(cè)范圍為基因Ⅶ型新城疫病毒核酸。

　　1.3檢測(cè)對(duì)象為雞新城疫活疫苗La Sota株、Clone30株、F株、HB1株、N79株、CS2株、V4/HB92株、ZM10株、VG/GA株等疫苗株。

　　2.試驗(yàn)材料

　　2.1引物

　　針對(duì)雞新城疫病毒(Newcastle Disease Virus,NDV)F基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)一對(duì)通用型引物。

　　NDV-F(Universas型)-F:5’-ACAGGRTCAATCATAGT-3’

　　NDV-F(Universas型)-R:5’-CAGTAWGAGGTGTCAAG-3’

　　針對(duì)基因Ⅶ型新城疫病毒F基因差異序列，設(shè)計(jì)一對(duì)基因Ⅶ型特異性引物。

　　NDV-F(Ⅶ型)-F:5’-AGTTTAATAATACGGCGCGA-3’

　　NDV-F(Ⅶ型)-R:5’-GCAATAACTGAGCCYYTAAG-3’

　　2.2陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照

　　陽(yáng)性對(duì)照:

　　雞新城疫病毒La Sota株，毒種編號(hào)為CVCC AV1615，來(lái)源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心。

　　基因Ⅶ型新城疫病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品，編號(hào)為CVCC Z333，來(lái)源于國(guó)家獸醫(yī)微生物菌(毒)種保藏中心。

　　陰性對(duì)照:生理鹽水或無(wú)菌水。

　　2.3試劑

　　RNA提取試劑盒、RT-PCR試劑、瓊脂糖、50xTAE、DNA

　　marker、無(wú)核酸酶水、生理鹽水。

　　3.檢測(cè)方法

　　3.1樣品稀釋

　　取疫苗按瓶簽標(biāo)示,用生理鹽水稀釋至每毫升至少含100羽份；;陽(yáng)性對(duì)照按瓶簽標(biāo)示原倍或10倍稀釋后使用。

　　3.2RNA提取

　　將稀釋后的疫苗和陰、陽(yáng)性對(duì)照按商品化核酸提取試劑盒進(jìn)行RNA核酸提取。

　　3.3RT-PCR反應(yīng)

　　將3.2步驟提取的RNA進(jìn)行一步法RT-PCR反應(yīng)，一步法RT-PCR反應(yīng)程序如下:50°C 30min,92°C 2min、94°C 30s、55°C 30s、72°C 1min,共30個(gè)循環(huán),最后72°C延伸10min。一步法RT-PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1:

　　表1一步法RT-PCR反應(yīng)體系(25μL)

　3.4電泳

　　配置1%瓊脂糖凝膠,取10μl RT-PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳，120V，30min。

　　4.結(jié)果判定

　　4.1試驗(yàn)成立條件,新城疫病毒(La Sota株)通用型引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為842bp條帶，基因Ⅶ型新城疫病毒特異性引物應(yīng)無(wú)條帶；基因Ⅶ型新城疫病毒核酸標(biāo)準(zhǔn)品通用型引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為842bp條帶，基因Ⅶ型新城疫病毒特異性引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為609bp特異性條帶；陰性對(duì)照均無(wú)條帶，則試驗(yàn)成立。

　　4.2樣品用新城疫病毒通用型引物應(yīng)擴(kuò)增出大小約為842bp條帶。若用基因Ⅶ型新城疫病毒特異性引物擴(kuò)增出大小約為609bp條帶，則判定樣品中檢出基因Ⅶ型新城疫病毒核酸。

　　附件4

　　禽用滅活疫苗中非法添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原檢測(cè)方法

　　1.適用范圍

　　1.1本方法適用于禽用滅活疫苗中非法添加制苗用毒種的檢測(cè)。

　　1.2非法添加制苗用毒種的檢測(cè)范圍為禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原。

　　2.試驗(yàn)材料

　　2.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

　　SPF雞，4~6周齡。

　　2.2試劑

　　禽腺病毒Ⅰ群瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原，陰性對(duì)照為SPF雞血清，陽(yáng)性對(duì)照為禽腺病毒Ⅰ群瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)陽(yáng)性血清，均來(lái)源于中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；瓊脂粉或瓊脂糖、氯化鈉、PBS(0.01M、pH7.2)。

　　3.檢測(cè)方法

　　3.1免疫

　　用4~6周齡SPF雞15只,其中10只雞按制品推薦的免疫途徑和劑量進(jìn)行免疫。首次免疫后14天，按照相同途徑(不同部位)和劑量進(jìn)行第二次免疫。另取5只作為不免疫對(duì)照組。第二次免疫后21日每只雞分別采血，分離血清，用禽腺病毒I群瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)抗原進(jìn)行抗體效價(jià)測(cè)定。

　　3.2抗體效價(jià)測(cè)定

　　3.2.1瓊脂板制備

　　稱取優(yōu)質(zhì)瓊脂粉或瓊脂糖1g、氯化鈉8g,加入PBS(0.01M、pH7.2)溶液100ml中，置沸水中水浴加熱融化，室溫冷卻至60~65℃后，倒入無(wú)菌平皿內(nèi)(瓊脂厚度約為5mm)，冷凝后加蓋倒置平皿，防止水分蒸發(fā)，隔日使用應(yīng)在2~8℃保存。

　　3.2.2打孔

　　用六角形打孔器在瓊脂上打孔，孔徑3~4mm，孔間間距3mm。

　　3.2.3封底

　　挑出孔中瓊脂后,將平皿底部至酒精燈上微微加熱，使孔底瓊脂稍微融化封底。

　　3.2.4加樣

　　中央孔滴加瓊擴(kuò)抗原50μl，第2、4孔滴加陽(yáng)性對(duì)照各50μl，第6孔滴加陰性對(duì)照50μl,第1、3、5孔滴加待檢血清，每孔50μl。

　　3.2.5反應(yīng)將瓊脂板放入濕盒中，置37℃溫箱內(nèi)2小時(shí)后倒置瓊脂板，繼續(xù)作用至24小時(shí)，然后移至室溫再放置48~72小時(shí)，觀察沉淀線。

　　3.2.6瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)(AGP)抗體檢測(cè)結(jié)果判定

　　3.2.6.1試驗(yàn)成立條件，抗原孔與陽(yáng)性對(duì)照之間出現(xiàn)沉淀線，與陰性對(duì)照之間無(wú)沉淀線出現(xiàn)，抗體檢測(cè)試驗(yàn)成立。

　　3.2.6.2當(dāng)待檢血清與抗原孔之間形成沉淀線，并與陽(yáng)性對(duì)照的沉淀線末端吻合，則待檢血清判為陽(yáng)性；當(dāng)待檢血清與抗原孔之間未形成沉淀線，但陽(yáng)性對(duì)照的沉淀線末端向待檢血清孔內(nèi)側(cè)偏彎,則判為弱陽(yáng)性。弱陽(yáng)性樣品應(yīng)重檢一次，仍為弱陽(yáng)性時(shí)可判為陽(yáng)性；當(dāng)待檢血清與抗原孔之間未形成沉淀線，或陽(yáng)性對(duì)照與抗原孔間的沉淀線末端向毗鄰的待檢血清孔直伸或向外側(cè)偏彎時(shí)，則判該待檢血清為陰性。

　　4.結(jié)果判定

　　4.1試驗(yàn)成立條件,對(duì)照組雞AGP抗體應(yīng)全部為陰性,試驗(yàn)成立。

　　4.2若待檢樣品免疫雞血清1份及以上出現(xiàn)AGP抗體陽(yáng)性，則判定該疫苗中添加了禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原；若待檢樣品免疫雞血清均未出現(xiàn)AGP抗體陽(yáng)性，則判定該疫苗中未添加禽腺病毒Ⅰ群全病毒抗原。

來(lái)源：農(nóng)業(yè)農(nóng)村部。